盤龍七片調節骨保護素/核因子kB受體活化因子配體信號通路對去卵巢骨質疏松大鼠的影響
盤龍七片可能通過抑制RANKL水平，上調OPG表達，改善去卵巢大鼠的骨質疏松癥狀。
骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種全身性骨代謝疾病，其主要特征是骨量減少、骨組織細微結構退化、骨強度降低，其潛在機制是骨骼吸收與骨骼成骨之間的不平衡，表現為骨脆性及骨折危險性增加。
研究表明絕經后骨質疏松癥(PMOP)是骨質疏松癥最常見的一種，絕經后老年女性的骨質疏松發病率高達49％，常因輕度暴力或非創傷因素而導致脆性骨折。
骨保護素(OPG)、核因子-kB受體活化因子配體(RANKL)是重要的信號轉導蛋白，OPG/RANKL信號通路在骨代謝的骨吸收過程中起著至關重要的作用，能影響破骨細胞在骨重構中生成、分化、成熟和功能的激活。
盤龍七片是一種中成藥，臨床上對不同的骨科疾病具有明顯的臨床療效，調節骨代謝，改善骨科疾病。中醫學認為骨質疏松癥的發病與“血瘀”有關，并將其歸于“骨痹”“骨痿”等范疇。盤龍七片有活血化瘀、通經活絡、強筋壯骨的作用，恰好切中“骨痹”之要害。已有研究發現，盤龍七片在對骨質疏松性椎體壓縮骨折患者術后恢復的治療過程中具有顯著作用。
因此，本研究通過建立去卵巢大鼠模型探究盤龍七片對去卵巢骨質疏松大鼠的藥效作用以及對股骨組織中 OPG/RANKL信號通路的影響。
1.材料與方法
1.1.動物
實驗所用大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,75只雌性 SD(Sprague Dawley)大鼠,4個月齡,SPF級,體質量(338.26±20.48)g,所有大鼠均在動物房中飼養,保持動物房環境及鼠籠清潔、通風,12h的光/暗周期,溫度(24±2)℃,相對濕度為58％±2％,自由獲取飼料和飲水。
1.2.主要試劑及儀器
盤龍七片(國藥準字Z61020050,陜西盤龍藥業集團股份有限公司)等。
雙能X線骨密度分析儀(美國NORLAND公司)；光學顯微鏡(Nikon Eclipse80i,日本)；MX-0580-骨科生物力學測試儀(中國上海衡翼精密儀器有限公司)等。
1.3.方法
1.3.2.給藥處理 造模完成24h后,假手術、模型組皮下注射10mL/kg0.9％生理鹽水,陽性藥組(1mg/kg)每天皮下注射10mL/kg 17β-雌二醇(0.1mg/mL)；盤龍七片換算設置低(0.26g/kg)、高劑量組(1.29g/kg)，并用生理鹽水配置為0.026,0.129g/mL混懸液以10mL/kg的劑量灌胃給藥，1次/d，持續給藥8周。
1.3.3.大鼠存活情況 實驗進行過程中,各組大鼠存在不同數量的死亡,最后,假手術組納入實驗15只,模型組13只,陽性藥物組14只,低劑量組14只,高劑量組15只。
1.3.4.樣本采集 骨密度測完后,用酒精和碘伏消毒手術部位,開腹,腹主動脈采血,1500r/min離心15min,取上層血清,取出大鼠左后肢股骨,滅菌后-70℃保存。
1.3.5.骨密度測定 各組大鼠左后肢離體股骨平置于雙能X線骨密度平臺上測定左股骨部位骨礦含量。
1.3.6.骨生物力學檢測 左側股骨放在生物力學萬能實驗機上,壓頭以2mm/min速度下降,直至股骨斷裂。采集數據并繪制載荷-變形曲線,測得******撓度、彈性載荷、彈性撓度,計算出******載荷和彈性模量。
1.3.7.HE染色 左側股骨遠端用含10％福爾馬林的乙二胺四乙酸溶液(EDTA)脫鈣4周后石蠟包埋。將石蠟包埋的股骨組織切成4μm切片的標本進行HE染色。用光學顯微鏡對染色的股骨進行觀察和成像。
1.3.8.血清中骨代謝標志物β-CTX、BALP濃度 檢測各組動物血清中血清β-膠原降解產物(β-CTX)、骨堿性磷酸酶(BALP)含量等指標,具體操作按試劑盒說明書進行。
2.結果
2.1.盤龍七片對去卵巢大鼠骨密度的影響
各且大鼠左后肢離體股骨骨密度比較見表1，與假手術組相比，模型組大鼠BMC顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；與模型組相比，陽性藥物組、低劑量組、高劑量組BMC含量明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與陽性藥物組相比，低劑量組BMC較低，差異有統計學意義(P＜0.05)，高劑量組BMC較高，差異有統計學意義(P＜0.05)。
2.2.盤龍七片對去卵巢大鼠骨生物力學特性的影響
各組大鼠左后肢離體股骨生物力學特性比較見表2，與假手術組相比，模型組******載荷與彈性模量均顯著下降，差異有統計學意義(P＜0.05）；與模型組相比，陽性藥物組、低劑量組、高劑量組******載荷與彈性模量明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與陽性藥物組相比，低劑量組******載荷與彈性模量較低，差異有統計學意義（P＜0.05），高劑量組******載荷與彈性模量較高，差異有統計學意義(P＜0.05)。
2.3.盤龍七片對去卵巢大鼠骨組織形態的影響
HE染色檢測大鼠左股骨病理損傷見圖1。與假手術組相比，模型組左側股骨遠端骨小梁稀疏、結構不完整、明顯變薄、排列紊亂，存在大量空骨陷窩，骨小梁連通性喪失，骨小梁間隙增寬；與模型組相比，低劑量組左側股骨遠端骨小梁有所改善，陽性藥物組與高劑量組左側股骨遠端骨小梁形態結構明顯改善，骨小梁結構完整，空骨陷窩減少，骨小梁排列更加整齊，高質量組恢復************。
3.討論
絕經后骨質疏松癥病理機制復雜，尚無有效、安全的治療方法。西藥主要采用骨吸收抑制劑(雌激素)、骨形成和骨礦化促進劑等治療手段。但這些藥物長期服用會引發一系列不良反應，如血栓形成、冠心病及乳腺癌等。中醫藥的方法治療骨科疾病是醫藥領域研究的熱點內容。
3.討論
絕經后骨質疏松癥病理機制復雜，尚無有效、安全的治療方法。西藥主要采用骨吸收抑制劑(雌激素)、骨形成和骨礦化促進劑等治療手段。但這些藥物長期服用會引發一系列不良反應，如血栓形成、冠心病及乳腺癌等。中醫藥的方法治療骨科疾病是醫藥領域研究的熱點內容。
本研究建立去卵巢動物模型，首先探討盤龍七片對骨質疏松大鼠骨密度的影響，結果顯示模型組大鼠BMC、******載荷與彈性模量顯著降低，HE染色結果顯示，模型組左側股骨遠端骨小梁稀疏、結構不完整、明顯變薄、排列紊亂，說明去卵巢后骨組織明顯受損嚴重，與李永賢等構建去卵巢大鼠模型后骨組織組織結構染色結果相一致，表明骨質疏松大鼠模型建立成功。給予盤龍七片治療后，大鼠BMC含量、******載荷與彈性模量明顯升高，低劑量組左側股骨遠端骨小梁有所改善，陽性藥組與高劑量組左側股骨遠端骨小梁形態結構均明顯改善，且高質量組恢復************，說明盤龍七片能顯著提高骨密度，提示盤龍七片有利于緩解大鼠的骨質疏松狀況。
PMOP是由于體內卵巢功能降低，引起骨偶聯過程RANKL和OPG蛋白分泌失衡，骨吸收超過骨形成，從而導致凈骨量減少，骨脆性增加，骨強度降低。研究表明多數中西藥對去卵巢后骨質疏松大鼠的治療機理都與OPG/RANKL通路有關。吳彬等研究發現雌馬酚能有效改善去卵巢后大鼠骨質疏松癥，可能與其能上調OPG而抑制RANKL分泌有關。顏春魯等發現地黃飲子可能通過調控 OPG/RANKL/RANK 信號通路發揮抗去卵巢大鼠骨質疏松的作用。
本研究中，去卵巢后模型組大鼠骨組織OPG蛋白表達水平較假手術組顯著下降，RANKL蛋白水平顯著上調，RANKL與OPG之間失衡，從而導致大鼠骨形成與骨吸收失衡，發生骨質疏松。給予盤龍七片治療后，陽性藥物組、低劑量組、高劑量組大鼠骨組織較模型組OPG蛋白表達水平顯著上升，RANKL蛋白水平顯著下降且高劑量組大鼠骨組織OPG蛋白表達水平最高，RANKL蛋白表達水平最低，說明盤龍七片能夠上調骨保護相關蛋白合成，促進骨形成作用，且效果優于陽性藥物，提示盤龍七片可能通過調控OPG/RANKL通路改善去卵巢大鼠的骨質疏松。
綜上所述
RANKL/OPG信號通路激活與PMOP病理過程有密切關系，盤龍七片可能通過抑制RANKL表達，促進OPG表達，促進骨形成，抑制骨吸收，進而減輕骨質疏松程度，可能為臨床上利用盤龍七片對PMOP治療提供了理論參考，但盤龍七片調控OPG/RANKL信號通路的具體機制仍需進一步探究。
陜公網安備61011102000338號
